pruebas sensibilidad

PRUEBA DE DIFUSIÓN DE SENSIDISCOS EN AGAR

Método generalmente utilizado y aprobado por el NCCLS para efectuar las puebras de sensibildad. Consiste en inocular mediante una torunda de algodón un inóculo estandarizado de microrganismos en la superficie de una placa Petri con medio Mueller Hinton. Discos de papel filtro impregnado en soluciones antimicrobianas se colocan en el agar. Después de incubar por 24 hrs. Se miden los halos de inhibición y se comparan con tablas entregadas por la NCCLS , y de esta manera se determina si los gérmenes son sensibles o resistentes a los diferentes agentes antimicrobianos.

PROCEDIMIENTO: Se utilizan placas de Agar Mueller Hinton de 4mm de profundidad, que se llevan a temperatura ambiente antes de inocular. Para preparar el inóculo se toman 5 colonias aisladas y se suspenden en 5 ml de Caldo Mueller Hinton, se incuba a 35°C por 2 a 8 hrs., hasta que el desarrollo alcance la turbidez del Standard Mac Farland 0.5. Con una torunda de algodón inocular la placa de agar en toda su superficie por tres veces en distintas direcciones. Dejar secar la placa por 10 a 15 minutos antes de colocar los sensidiscos . Estos deben ser colocados con una separación mínima de 24 mm entre ellos con una pinza estéril o un dispensador automático presionando levemente sobre el agar. Dejar difundir por 15 minutos y después incubar a 35°C por 16 a 18 hrs. Para leer los halos se coloca la placas invertidas sobre un fondo oscuro e iluminado, medir el halo de inhibición de crecimiento producido por los sensidiscos en milímetros. Comparar los halos de inhibición con las tablas de la NCCLS y así se determina la sensibilidad o resistencia del microorganismo a cada agente antimicrobiano.

TEST DE MICRODILUCIÓN CIM EN CALDO

El test de microdilución de Concentración Inhibitoria Mínima en caldo se utiliza para medir semicuantitativamente la actividad in Vitro de un agente antimicrobiano contra un microorganismo aislado. Una placa de microtítulo conteniendo varias concentraciones de agentes antimicrobianos se inocula con un número standard de bacteria, después de incubación por la noche a 35°C .la CIM se determina observando la concentración menor el antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible del gérmen. Los valores de la CIM se interpretan como sensibles, resistentes o intermedios según las tablas proporcionadas por la NCCLS.

PROCEDIMIENTO: Las placas de microtítulo conteniendo las diluciones de agentes antimicrobianos se dejan descongelar a temperatura ambiente. Para preparar el inóculo se toman 4-5 colonias aisladas y se suspenden en 5 ml de caldo Mueller Hinton. Se incuba a 35°C por 2 a 8 hrs., hasta que el desarrollo alcance la turbidez del Standard Mac Farland 0.5 .Calcular el volumen de la suspensión estandarizada que se debe agregar a una solución de 25 ml de agua-tween 80 para obtener una concentración final de 3 a 5 x10*5 UFC/ml en un volumen de 0.01ml. ( Mac Farland 0.5 = 1.5x10*8 UFC/ml por lo tanto, 1 ml en 25 ml del diluyente agua-tween 80 dará una concentración final de 5 a 6 x10*5 UFC en 0.01 ml.).

Agregar el volumen de suspensión microbiana calculado a 25 ml de diluyente agua-tween 80 con una micropipeta, mezclar por inversión 4 a 6 veces sin producir burbujas. Después de 1 hora inocular la placa de microtítulo inoculando 0.01ml de la suspensión en cada pocillo, evitando inocular el pocillo blanco. Incubar las placas a 35°C por 16 a 20 hrs. Interpretar las CIMs basandose en el criterio de la NCCLS, en sensibles , intermedios o resistentes a los agentes antimicrobianos.

MICROORGANISMOS CON RESISTENCIA INTRINSECA

STAPHYLOCOCCUS RESISTENTE A LA OXACILINA: Descrito también como Meticilina reisistentes , han aparecido internacionalmente como un patógeno nosocomial mayor. La incidencia de este microorganismo ha aumentado constantemente desde los años '80 no solamente en hospitales clínicos, sinó también en centros de atención comunitaria, encontrándose generalmente en drogadictos que utilizan drogas intravenosas, y pacientes con enfermedades graves . Un 30 a 50% de los Staphylococcus epidermidis coagulasa negativa se han reportado como meticilina resistente (oxacilina-nafcilina y meticilina) produciendo un 35% de casos fatales. Para identificar estas cepas meticilina-resistentes es recomendable efectuar una pueba de difusión en agar Mueller Hinton utilizando sensidiscos de oxacilina de 1 ug , incubar 24 hrs completas a 35°C (no superior) examinar halos de inhibición buscando colonias aisladas dentro del halo e interpretar según los standards de la NCCLS (mayor de 13 mm es susceptible, menos de 10 mm es considerado resistente y halos entre 11 y 12 se consideran intermedios, a estas últimas cepas se les debe efectuar un test de microdilución y determinar la CIM para la oxacilina. En el caso de Staphylococcus aureus meticina resistentes los standards varían (se utilizan discos de 2ug) .

Se han detectado cepas de Staphylococcus aureus resistentes no sólo a la meticilina , también son tolerantes a los agentes antimicrobianos beta-lactámicos, esta tolerancia es determinada in vitro por las pruebeas de CIM y CBM , y se define como una relación entre ámbas mayor o igual a 32:1.

ENTEROCOCOS RESISTENTES A AMINOGLICÓSIDOS: Durante los últimos 20 años se ha demostrado el aumento frecuencia y mortalidad de las infecciones producidas por Enterococcos . En los '80 los enterococos aparecieron como un agente infeccioso nosocomial de importancia, siendo responsables de sobre el 10% de las infecciones nosocomiales y asociado a una mortalidad del 19,6 al 71,4 % en casos de bacteremia. Se ha determinado que el incremento en estas infecciones está asociado con el aumento de la utilización de drogas de amplio espectro, particularmente cefalosporinas. Aproximadamente el 90% de los enterococos aislados son E.faecalis ,E faecium, raramente se encuentran E.durans y E avium. La infección a enterococo más común es la infección urinaria y de valvulas cardíacas, más infrecuente se observan abscesos a tejidos blandos, osteomielitis meningitis y peritonitis.

Para determinar esta resistencia se efectúa un test de sensibidad utilizando discos de 300 ug de streptomicina y 120 ug de gentamicina con un inóculo de 10*6 UFC/ml en Agar Mueller Hinton+Sangre.Se interpreta según los criterios de la NCCLS.

Se han detectado enterococos resistentes a los agentes beta-lactamicos se reconocen por una CIM mayor de 100 ug/ml de penicilina , y en algunos casos resistencia a la vancomicina.

STREPTOCOCCUS GRUPO D RESISTENTES : Se han aislado cepas en endocarditis que son tolerantes a la penicilina, vancomicina y cefalotina. Por lo tanto al aislar un Streptococcus grupo D de un hemocultivo se debe sospechar de una de estas cepas. Para identificarlas se hace un test de microdilución detérminandose el CIM para la penicilina.

STREPTOCOCCUS VIRIDANS RESISTENTES :Existe un grupo de Streptococcus denominado 'nutricionalmente deficientes' , los cuales son Streptococcus viridans los cuales son incapaces de desarrollarse en medios carentes de Vit.B, piridoxal o piridoxamina, y son tolerantes a la penicilina. El significado clínico de estos gérmenes radica en su asociación a endocarditis las cuales llegan al 50% del total de las endocarditis diagnosticadas. Para identificar estas cepas se efectúa un test de sensibilidad a la penicilina en Caldo Mueller Hinton suplementado con sangre de caballo y piridoxal En estos casos se utiliza una terapia combinada de penicilina + vancomicina o rifampicina que ha demostrado ser exitosa.

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE RESISTENTES: Las cepas de S.pneumoniae resistentes a la penicilina se definen como aquellas cuya CIM es igual o mayor a 1.0 ug/ml, cepas cuya CIM es de 0.2 a 1.0 ug/ml se clasifican como relativamente resistentes. Estas cepas son relativamente escasas pero se constituyen en endémicas en ciertas áreas geográficas con casos reportados de 7 a 15,5% ; además muestran una sensiblidad disminuída a otros agentes beta-lactámicos incluídas las cefalosporinas. S.pneumoniae aislado de sangre, LCR, y otros sitios normalmente estériles del organismo deben ser examinados en forma rutinaria para la sensibilidad a la penicilina., como también las cepas provenientes de tratamientos fallidos.

HAEMOPHYLUS INFLUENZAE RESISTENTES: Estos microorganismos causan una variedad de enfermedades, incluyendo epiglotitis, sinusitis, otitis media, meningitis, septicemia, celulitis y neumonía. H.influenzae serotipo B productores de beta-lactamasa se aislan en un promedio de 21% , se asocian frecuentemente con infecciones nosocomiales de hospitales pediátricos, pacientes entre 3 meses y 5 años, e infecciones como meningitis o bacteremia. De los H.influenzae aislados se encontró un 20% resistente a ampicilina que además son resistentes al cloranfenicol en conjunto o aisladamente. Para identificar estas cepas se debe efectuar una prueba de sensibilidad a la penicilina, ampicilina, cloranfenicol, en agar HTM, (Haemophylus Test Media) con un inóculo standrard Mac Farland 0.5 , con incubación por 16 a 18 hrs., en microaerofilia. Se interpreta según los criterios de la NCCLS y sus tablas.

NEISSERIAE GONORRHOEAE RESISTENTES: Las cepas de N.gonorrhoeae productosras de penicilinasa son escasas no llegan al 2% , pero se convierten en endémicas en ciertos sitios geográficos, llegando a una incidencia del 35% de los casos de gonorrea. Muchas de estas cepas muestran una resistencia moderada a la tetraciclina con un CIM igual o mayor a 2ug/ml. con una resistencia moderada a la tetraciclina y sensibilidad disminuída a la eritromicina, cefoxina y trimetoprim-sulfametoxasole. Para identificar estas cepas se debe efectuar una prueba de sensibilidad en Agar GC suplementado con isovitalex, se utiliza un inóculo satandard Mac Farland 0.5 .Se efectúa el test según las normas del NCCLS M2-A4. Se incuban las placas a 35°C por 24 hrs. ,en microaerofilia. Se interpreta la prueba según el mismo standard.

NEISSERIAE MENINGITIDIS RESISTENTES. : Se han descrito cepas de N.meningitidis resistentes a la penicilina con resistencia moderada a la rifampicina. Hasta la fecha éstas han sido de escasa ocurrencia, pero aún así, se debe efectuar una prueba de sensibilidad a estos antimicrobianos cada vez que se detecta un tratamiento fallido o en casos de epidemias, o en la selección de drogas para profilaxis. Para efectuar estas pruebas se utiliza Agar Mueller Hinton, con un inóculo standard Mac Farland 0.5 , se utilizan discos de penicilina de 10U y rifampicina de 5ug. Incubar por 18 a 24 hrs., en microaerofilia. Se interpreta leyendo el halo de inhibición, para la rifampicina :si es mayor o igual a 20mm es susceptible, si es menor de 16 mm indica resistencia. Para la penicilina se observan las normas del NCCLS.